Eggs and chicken embryos as potential sentinels for flock and hatchery health

Abstract

Successful hatching of strong, healthy chicks with a potential for good productive and reproductive performance depends on the assurance of as normal and ideal as possible embryonic development. The latter, however, can be negatively affected by a series of factors intrinsic to either the egg, its handling, or the incubator. This project aimed at collecting and interpreting essential and extensive information regarding embryonal response to physical challenges (temperature, relative humidity and carbon dioxide concentration) in the incubation environment, to infectious challenge with vertically transmitted Salmonella serovars Enteritidis and Typhimurium and, ultimately, to apply the knowledge obtained to a field survey of a commercial hatchery. For this purpose, eggs were incubated under different, controlled environments or after infection with a vertically transmitted pathogen, and an extensive list of parameters used to monitor subsequent changes in embryonic behavior, metabolism, growth and viability. The information gathered was then applied to a sample of non-viable eggs incubated at a major hatchery. Overall, the effects of manipulating temperature were more prominent than those of manipulating humidity and carbon dioxide. The most significantly affected parameters pertained to embryo metabolism, embryo weight, mortality and malformation rates. Changes in the development of the lymphoid follicles in the bursa of Fabricius and of the glandular epithelium of the gizzard were also found. Vertical infection with Salmonella was associated with higher embryonic mortality rates. No changes in performance or growth were observed in infected but viable embryos. The results obtained during the field survey did not directly correlate to the variables studied. However, the issues detected allowed for the designation of critical control points and opportunities for performance improvement that could have otherwise gone undetected at the hatchery and at the breeder farm, highlighting the importance of embryodiagnosis in the monitoring of hatchery and flock health.

A operação eficiente e lucrativa de uma exploração industrial produtora de espécies aviárias (Gallus gallus) depende, entre outras coisas, do acesso a pintos saudáveis e com bom potencial produtivo, obtidos por incubação artificial de ovos de um bando reprodutor. É com a incubação destes ovos, levada a cabo em grande escala por máquinas altamente especializadas, que se inicia o desenvolvimento das aves, tendo esta influência directa sobre a viabilidade e futura performance do pinto eclodido. Vários factores podem intervir negativamente no sucesso da incubação, estando estes relacionados com o ovo em si, com o seu manuseamento ou com a própria incubadora. Por essa razão, este trabalho teve por objectivo adquirir, coligir e interpretar informação essencial sobre a resposta embrionária a alterações físicas do ambiente de incubação (temperatura, humidade relativa (RH) e concentração de dióxido de carbono), assim como à infecção com agentes patogénicos com transmissão vertical conhecida (Salmonella enterica vars. Enteritidis e Typhimurium). Estes ensaios foram conduzidos em laboratório, em ambiente cuidadosamente controlado. Numa segunda fase, o conhecimento obtido através de experimentação laboratorial foi aplicado na análise de uma amostra de ovos incubados provenientes de um centro de incubação industrial, com o objectivo de verificar a compatibilidade dos dados experimentais com os dados obtidos em situação real. Com vista a estudar a influência de alterações no ambiente de incubação sobre o desenvolvimento embrionário, procedeu-se à incubação de 2300 ovos specificpathogen free, dividos em dez grupos diferentes. O primeiro grupo foi incubado sob condições controlo (temperatura - 37.8ºC; RH - 50-55% durante os primeiros 18 dias de incubação e 60-65% durante os últimos 3 dias) e os restantes cinco grupos incubados sob: A) temperatura elevada constante (38.9ºC) e RH padrão; B) temperatura inferior constante (36.7ºC) e RH padrão; C) temperatura e RH padrão com um período (3 h) de elevação da temperatura (38.9ºC) aos dias 3 e 18 de incubação; D) temperatura e RH padrão com um período (3 h) de redução da temperatura (36.7ºC) aos dias 3 e 18 de incubação; E) humidade relativa elevada constante (63%) e temperatura padrão; F) humidade relativa inferior constante (43%) e temperatura padrão; G) humidade relativa e temperatura padrão com um período (3 h) de elevação da RH (63%) aos dias 3 e 18 de incubação; H) temperatura padrão com um período (3 h) de redução da RH (43%) aos dias 3 e 18 de incubação; I) ausência de renovação de ar/concentração de CO2 elevada constante durante incubação sob temperatura e RH padrão. Para investigar a influência da infecção com microrganismos transmitidos verticalmente, foram utilizados 576 ovos specific-pathogen free, divididos por oito grupos, quatro grupos controlo e quatro grupos inoculados. O primeiro grupo tratado foi inoculado com 105 CFU/ml de uma cultura de referência de S. enterica var. Enteritidis (CECT-4300) em NaCl (0,9%) estéril. O segundo grupo foi inoculado com 102 CFU/ml (dose de inoculação semelhante à concentração destas bactérias previamente reportada em ovos naturalmente infetados) da mesma cultura de referência. O terceiro grupo foi inoculado com 105 CFU/ml de uma cultura de referência de S. enterica var. Typhimurium (CECT-443) em NaCl (0,9%) estéril. Finalmente, o quarto grupo foi inoculado com 102 CFU/ml da mesma cultura de referência. Cada grupo tratado foi incubado juntamente com um grupo controlo inoculado com NaCl (0.9%) estéril. A presença ou ausência de Salmonella em cada grupo foi confirmada através de PCR multiplex convencional. Em todos os ensaios, foi retirada uma amostra de ovos da incubadora a cada 48 horas de incubação para análise dos efeitos das diferentes manipulações sobre o desenvolvimento embrionário. Uma extensa lista de parâmetros relacionados com o comportamento, metabolismo, crescimento e viabilidade dos embriões foi depois analisada. Em relação ao estudo de campo, foi efetuada análise morfológica, histológica e microbiológica de uma amostra de 51 ovos não viáveis, obtidos após 21 dias de incubação, num centro de incubação industrial. Relativamente aos ensaios de manipulação do ambiente físico de incubação, os resultados obtidos permitiram concluir que as alterações de temperatura, em qualquer direção, exerceram efeitos mais marcados sobre o desenvolvimento embrionário do que as alterações na humidade relativa ou na concentração de CO2 no interior da incubadora, enquanto que estas duas últimas variáveis produzem efeitos na sua maior parte sobreponíveis. Dos parâmetros monitorizados, aqueles que mais consistentemente apresentaram alterações encontravam-se relacionados com o comportamento e metabolismo embrionários, nomeadamente com a diminuição do metabolismo embrionário como consequência do stress induzido pela manipulação. O crescimento embrionário, representado pelo peso do embrião e por parâmetros alométricos, foi igualmente afetado, tendo-se verificado que as alterações de temperatura resultaram em embriões mais leves, enquanto as alterações de humidade relativa e CO2 produziram embriões de tamanho semelhante mas peso superior aos dos restantes tratamentos. À análise histológica, os embriões sujeitos a alterações contínuas de temperatura apresentaram ainda atraso na formação do tecido linfoide da bolsa de Fabricius e alterações celulares com distorção da arquitetura do epitélio glandular da moela, estas últimas em embriões sujeitos a aumentos de temperatura). Os embriões sujeitos a modificações da humidade relativa produziram efeitos temporários sobre o desenvolvimento do tecido hepático. As lesões microscópicas encontradas em animais mortos durante a incubação não permitiram o diagnóstico fiável da(s) causa(s) imediata de morte. Nenhum dos tratamentos produziu elevação significativa dos níveis de mortalidade, à exceção da incubação sob temperaturas inferiores ao normal. Dos restantes tratamentos, a elevação da humidade relativa resultou num aumento da mortalidade no final do período de incubação. Ainda relativamente à viabilidade embrionária, verificou-se que apenas as manipulações da temperatura de incubação resultaram num aumento significativo na incidência de malformações espontâneas. Finalmente, é de notar que, para todas as variáveis estudadas, a alteração contínua de uma variável produziu efeitos mais pronunciados e duradouros, enquanto a alteração pontual e temporária de uma variável produziu efeitos mais limitados, tanto em amplitude como em duração. Ao contrário dos ensaios de manipulação do ambiente de incubação, a inoculação de ovos specific-pathogen free não incubados com serovars de Salmonella enterica e sua posterior incubação não produziu alterações significativas no comportamento, metabolismo ou desenvolvimento embrionários. A inoculação de S. Enteridis, tanto em inóculo alto como em inóculo baixo, resultou num aumento significativo da taxa de mortalidade, sendo que esta se encontrou limitada aos primeiros 7 dias de incubação. A inoculação com qualquer dos inóculos de S. Typhimurium produziu, igualmente, níveis de mortalidade superiores comparados com os controlos, limitados aos primeiros dias de incubação, mas inferiores aos produzidos por S. Enteritidis. As lesões microscópicas observadas em animais encontrados mortos não permitiram o diagnóstico fiável da(s) causa(s) imediata de morte, sendo que a única diferença significativa encontrada se restringiu a alteração da afinidade tintoral dos tecidos provenientes de embriões infetados, indicativa de decomposição mais acelerada provavelmente devido a maior proliferação bacteriana. Contudo, nenhum dos embriões viáveis inoculados apresentou qualquer alteração macroscópica ou histológica significativa e em nenhum destes animais se observaram agregados bacterianos à análise microscópica, apesar da presença de infeção confirmada por métodos de biologia molecular. Os resultados obtidos sugeriram, ainda, que ambos os serovars de Salmonella utilizados apresentam tropismo para o embrião, possuindo a capacidade de não só sobreviver dentro do ovo, mas também de atravessar compartimentos orgânicos em direção ao embrião. Estas observações evidenciam algumas das razões para a eficiência demonstrada por estes serovars (e particularmente S. Enteritidis) na transmissão vertical e estabelecimento de portadores assintomáticos. Em relação ao estudo de campo, a análise dos ovos não viáveis não evidenciou diminuição de performance ou viabilidade embrionária devido a qualquer das variáveis estudadas em laboratório. Contudo, o exame externo, macroscópico dos ovos, assim como a sua análise microbiológica evidenciaram problemas na seleção e calibração dos ovos para incubação, assim como na possível higiene e práticas de recolha dos ovos na exploração de reprodutores, sinalizando potenciais pontos de intervenção futura com vista ao melhoramento da performance de incubação que de outra forma não seriam detetados. Finalmente, este trabalho permitiu a aquisição de informação essencial para a compreensão da resposta embrionária aos desafios da incubação, permitindo ainda confirmar a importância do embriodiagnóstico na monitorização da saúde da incubadora e do bando.