http://hdl.handle.net/10400.5/110 2020-06-27T03:11:25Z http://hdl.handle.net/10400.5/20150 Título: Novel therapeutic strategies for the management of diabetic foot infections : the evaluation of selected antimicrobial peptides against clinically isolated bacterial pathogens Autor: Santos, Tânia Raquel Martins dos Resumo: Diabetic foot infections (DFIs) are a frequent complication of Diabetes mellitus. These ulcers are prone to be colonized by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, including multidrug resistant and biofilm-producing strains, possibly leading to DFI chronicity and amputation. New therapeutic strategies for DFI management are urgent and the antimicrobial peptides (AMPs) nisin and pexiganan are potential candidates. This project aimed to evaluate the activity of these AMPs, incorporated in a guar gum biogel, against selected DFI clinical isolates. Firstly, nisin’s activity against a collection of S. aureus DFI clinical isolates was determined. Results showed that nisin was able to inhibit and eradicate S. aureus planktonic and biofilm cells at concentrations below its acceptable daily intake. When incorporated in the biogel, nisin kept its antimicrobial activity. This work also evaluated the potential of nisin to complement the activity of conventional antiseptics and antibiotics against established biofilms formed by these isolates. An in vitro antimicrobial schematic protocol was developed to mimetize DFI management guidelines. Fifteen antimicrobial combinations, including nisin-biogel, chlorhexidine, clindamycin, gentamicin and vancomycin, were tested. Results showed that the higher levels of biofilm inhibitory effects were presented by therapeutic combinations that included the nisin-biogel formulation. Nisin-biogel ideal storage conditions and cytotoxicity were also evaluated. Results demonstrate that if stored at temperatures between -20 and 22ºC, nisin-biogel is able to maintain its antimicrobial activity up to 24 months. Moreover, after 24 h of exposition, the nisin-biogel presented no significant levels of toxicity regarding the human keratinocytes under study. Lastly, to cover the complex microbiota present in DFIs, a combination of AMPs with different action spectra was developed, based on the simultaneous incorporation of nisin and pexiganan in the biogel. The activity of this dual-AMPs formulation was tested against two S. aureus and P. aeruginosa strains isolated from the same DFI. Acting together, these AMPs were able to diffuse from the biogel and inhibit and eradicate biofilms formed by these DFI isolates. The effectiveness of AMPs, particularly nisin and pexiganan, as novel antimicrobial strategies for the management of DFIs is still an unknown territory that merits investigation. In vitro biofilm models are the basis of preliminary research; however, they underrepresent the complex microbiota present in DFIs and their interaction with the immune system and skin cells constituents. Further research is necessary to understand the AMPs full potential regarding the clinical management of biofilm-related diseases, such as DFIs.; RESUMO - As infecções do pé diabético (IPDs) são uma complicação frequente da Diabetes mellitus. Estas úlceras tendem a ser colonizadas por Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, incluindo estirpes multirresistentes e produtoras de biofilme, possivelmente causando cronicidade da IPD e amputação. É urgente criar novas estratégias para o tratamento das IPD e os péptidos antimicrobianos (PAMs) nisina e pexiganan são potenciais candidatos. Este projecto avaliou a actividade destes PAM, incorporados num biogel de goma de guar, contra isolados de IPD. Primariamente, foi determinada a actividade da nisina contra uma colecção de S. aureus isolados de IPD. Os resultados mostraram que a nisina é capaz de inibir e erradicar S. aureus na forma planctónica e de biofilme a concentrações abaixo da dose diária recomendada. Quando incorporada no biogel, a nisina manteve a sua actividade. Foi ainda avaliado o potencial da nisina para complementar a actividade de antissépticos e antibióticos convencionais contra biofilmes formados por estes isolados. Foi criado um protocolo que simula in vitro o tratamento convencional das IPDs. Foram testadas 15 combinações de antimicrobianos, incluindo biogel de nisina, clorohexidina, clindamicina, gentamicina e vancomicina. Os resultados mostraram que o maior efeito inibidor de biofilmes pertencia a combinações que incluam o biogel de nisina. Foram também avaliadas as condições de armazenamento ideais para o biogel de nisina e a sua citotoxicidade. Quando armazenado a temperaturas entre -20 e 22ºC, o biogel de nisina manteve a sua actividade antimicrobiana durante pelo menos 24 meses. Adicionalmente, após exposição durante 24 horas, o biogel de nisina não apresentou níveis significativos de toxicidade relativamente aos queratinócitos humanos em estudo. Por último, para abranger a complexa microbiota presente nas IPDs, foi avaliada uma combinação de PAMs com diferentes espectros de acção, baseada na incorporação simultânea de nisina e pexiganan no biogel. A actividade desta formulação foi testada contra duas estirpes de S. aureus e P. aeruginosa isoladas da mesma IPD. Conjuntamente, estes PAMs foram capazes de se difundir do biogel e inibir e erradicar biofilmes formados por estes isolados. A eficácia dos PAMs como novas estratégias para o tratamento das IPD é ainda uma área desconhecida. Os modelos in vitro de biofilmes são a base da investigação; contudo, não representam a microbiota presente nas IPD nem a sua interacção com o sistema imunitário e outros constituintes celulares. É essencial continuar a investigar para compreender o potencial dos PAMs na terapêutica de doenças onde haja formação de biofilmes, como é o caso das IPDs. Descrição: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas 2020-02-28T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10400.5/20149 Título: Toxoplasma gondii Tubulin Cofactor B plays a key role in host cell invasion and replication Autor: Francisco, Samuel Nuno Furtado da Conceição Resumo: Tubulin cofactors participate in the folding, dimerization, and dissociation pathways of the tubulin dimer, being implicated in the control of tubulin proteostasis and consequently in the control of microtubule (MT) dynamics in vivo. We hypothesise that these proteins have a role in the regulation of MT cytoskeleton dynamics during Toxoplasma gondii host cell invasion. In this context, we characterized the Tubulin cofactor B (TBCB) in T. gondii. TBCB is a CAPGly domain-containing protein that together with TBCE, interact with and dissociate the tubulin dimer. The TBCB sub-cellular localization in T. gondii was studied using an in-house anti-TBCB serum. T. gondii lines overexpressing TBCB were obtained by random integration as well as TBCB conditional knockout lines by CRISPR/Cas9 system. TBCB transgenic clones were characterized by growing assays (plaque, invasion, replication and egress assays), western blot analysis and fluorescence microscopy (standard, confocal and super-resolution). TBCB showed a polarized localization, at the anterior region of the parasite, under the conoid and in close association with polar ring and subpellicular MTs. It did not present a clear co-localization with the apical complex secretory vesicles, although the interaction with rhoptries and micronemes cannot be excluded. TBCB overexpression lines showed a significant decrease in the capacity to form plaques, attributable to a proportional reduction in the capacity to invade. No differences were observed in replication and egress assays. The TgTBCB knockout line, showed a complete depletion of the protein and a viability no longer than a week. These lines showed a strong reduction in their capacity to invade the host cell and in their replication rate. In the absence of TBCB, cells have an altered axis of division resulting in abnormal division. Some parasites show the loss of the correct division axis and some parasites have four daughter cells forming inside instead of two. TBCB is a polarity marker in T. gondii and is involved in the invasion and replication processes. Its apical localization, together with TBCB mammalian partners already described (MT associated proteins) and the invasion phenotypes, suggest that TBCB can be involved in the intracellular traffic of secretory vesicles depending on MTs. Importantly, TBCB is an essential protein, constituting a good target for new control strategies.; RESUMO - O Cofactor B da Tubulina de Toxoplasma gondii tem um papel central na invasão da célula hospedeira e na replicação - Os parasitas protozoários pertencentes ao Filo Apicomplexa são agentes patogénicos responsáveis por um vasto leque de doenças. Apesar da grande biodiversidade deste filo, os mecanismos moleculares adjacentes ao processo de invasão das células hospedeiras parecem ser conservados entre as diferentes espécies. O processo de invasão das células hospedeiras tem gerado grande interesse em vários grupos, incluindo o nosso, visto ser um importante alvo para o delineamento de estratégias médicas profilácticas e terapêuticas. Assim, nos últimos anos o nosso grupo tem vindo a interessar-se pelo estudo e compreensão do envolvimento do citoesqueleto de microtúbulos, tanto do parasita como da célula hospedeira, no processo de invasão. Os nossos resultados anteriores em Besnoitia besnoiti mostraram que este parasita, aquando da interação com a célula hospedeira, sofre alterações dramáticas na sua forma e superfície, acompanhadas pela remodelação de estruturas específicas de microtúbulos (MTs), nomeadamente os MTs subpeliculares. Estas alterações foram evidenciadas através de uma marcação distinta da tubulina na zona posterior do parasita. Para além disso, o citoesqueleto de MTs da célula hospedeira também responde à entrada do parasita, resultados que, posteriormente, foram também obtidos em Toxoplasma gondii. Estudos anteriores em T. gondii demonstraram que os MTs subpeliculares são muito estáveis. Esta estabilidade está possivelmente relacionada com modificações pós-traducionais (MPT) da tubulina, uma vez que, ao contrário dos vertebrados, estes organismos possuem uma família multigénica de α- e β-tubulinas composta por um número reduzido de membros. As MPTs referidas parecem modelar a interação dos MTs com as proteínas que lhes estão associadas. Mais ainda, em T. gondii, foram descritas proteínas que cobrem os MTs, num padrão complexo e definido, e que são importantes para a estabilidade dos mesmos. Deste modo, as proteínas que interagem com os MTs podem desempenhar um papel crucial na regulação do citoesqueleto do parasita aquando da invasão da célula hospedeira. Outras proteínas importantes para a regulação da dinâmica do citoesqueleto de MTs são os cofactores da tubulina, os quais participam nas vias de “folding”, dimerização e dissociação do dímero de tubulina. Estes cofatores controlam a proteostase da tubulina, através do controlo da “pool” de tubulina solúvel, participando na regulação da dinâmica dos MTs in vivo. Consequentemente, estas proteínas são candidatas a desempenhar um papel crucial nas modificações observadas no citoesqueleto de MTs do parasita aquando da invasão da célula hospedeira. Neste contexto o nosso objetivo principal foi avaliar e caracterizar o papel do Cofator B da Tubulina (TBCB de “Tubulin-binding cofactor B”) em T. gondii. Esta é uma proteína relativamente pequena que possui um domínio CAP-Gly na sua extremidade C-terminal e um domínio semelhante à ubiquitina (UBL de “ubiquitin-like”) na extremidade N-terminal. Em conjugação com o Cofactor E da tubulina (TBCE de “Tubulin binding cofactor E”), o TBCB dissocia o dímero de tubulina, controlando desta forma a “pool” de tubulina solúvel disponível na célula e consequentemente a dinâmica do citoesqueleto de MTs. A escolha do parasita protozoário T. gondii como modelo biológico deve-se ao facto de o mesmo possuir um genoma totalmente sequenciado e bem anotado, juntamente com o vasto conjunto de ferramentas disponíveis para a sua manipulação genética. Neste trabalho identificámos o gene do Tbcb em T. gondii, analisámos os níveis de expressão por RT-PCR durante o processo de invasão da célula hospedeira e de replicação, estudámos a localização intracelular do TgTBCB usando um anticorpo produzido no nosso laboratório e recorrendo a microscopia confocal e de super resolução, examinámos o fenótipo de TBCB em excesso (sobre-expressão por integração ao acaso) e de ausência do TBCB (deleção do gene utilizando o sistema CRISPR/Cas9). Nestes dois últimos casos foram criadas e selecionadas linhas transgénicas de parasitas, as quais foram analisadas em ensaios de crescimento (formação de pacas, invasão, replicação e egresso) bem como por western blot e por microscopia de fluorescência. Da análise dos níveis da expressão do Tbcb de T. gondii durante o processo de invasão e de replicação do parasita na célula hospedeira, notámos uma diminuição significativa dos níveis de expressão às 4 horas após a invasão da célula hospedeira, à qual se seguiu uma fase de recuperação desses níveis. Quanto à localização sub-celular do TgTBCB, observámos que em T. gondii esta proteína tem uma localização polarizada, estando localizada essencialmente no polo anterior, junto do conoide, podendo, por vezes, ser também observada uma marcação menos abundante no polo posterior. Constatámos ainda que o TgTBCB co-localiza parcialmente com as proteínas 2 e 3 das micronemas e com a tubulina glutamilada. Foi ainda possível constatar que na região apical o TBCB em T. gondii parece co-alinhar com os MTs subpeliculares, MTs que afunilam para estarem ancorados ao anel polar. Desta forma, o TBCB também parece estar junto ou imediatamente abaixo ao anel polar apical. Observámos que o excesso de TgTBCB causa uma queda acentuada na capacidade de formar placas de lise em tapetes celulares, a qual foi acompanhada de forma proporcional por uma diminuição notória dos níveis de invasão de células pelos parasitas. Curiosamente, não verificámos qualquer alteração na replicação ou no egresso dos mesmos. Em relação à deleção do gene Tbcb do parasita, 72 horas após a indução da CRISPR/Cas9 comprovámos a completa ausência de TgTBCB por western blot. Observámos também que a viabilidade dos parasitas sem TgTBCB não supera uma semana e que após a indução da deleção do gene, os parasitas demonstraram uma enorme redução na capacidade de invasão e também de replicação. Isto é, os poucos parasitas que conseguiam invadir as células hospedeiras apresentavam enormes problemas na replicação. Por western blot, nos extratos proteicos insolúveis, notámos uma diminuição nos níveis de a-tubulina, tubulina acetilada e poliglutamilada. Estes resultados também foram confirmados por imunofluorescência. Constatámos ainda que os parasitas sem TgTBCB apresentavam vários problemas de divisão, entre eles a alteração do eixo de divisão, a perda do controlo da divisão e a formação de células com morfologia arredondada, compatível com a perda de polaridade. Por microscopia eletrónica observámos também a perda de polaridade dos parasitas bem como a presença de núcleos de dimensões muito superiores ao normal ou dois núcleos dentro da célula, sem que a divisão celular tivesse sido concluída. Concluindo, o TgTBCB é uma proteína com uma localização polar, sendo observada no polo anterior abaixo do conoide e junto ao anel apical polar, acompanhado os MTs subpeliculares na região apical. A sua co-localização parcial com as proteínas das micronemas e com os MTs subpeliculares, bem como os seus parceiros já descritos em células de mamífero (proteínas de ligação aos MTs), juntamente com o fenótipo de invasão, sugerem que esta proteína em T. gondii poderá estar envolvida no tráfego vesicular ao longo dos MTs subpeliculares. A sobre-expressão do TgTBCB demonstrou a importância desta proteína no processo de invasão e a sua deleção provou que é essencial quer para a invasão quer para a replicação do parasita, visto que na ausência de TgTBCB há um comprometimento irreversível do citoesqueleto de MTs do parasita, levando à morte em menos de uma semana. Este fenótipo, aparentemente, está associado à diminuição dos MTs subpeliculares bem como à impossibilidade de formar novos MTs nas células filhas. Em suma, o TgTBCB é uma proteína essencial em T. gondii, podendo constituir um novo potencial alvo para novas estratégias de controlo e tratamento do parasita. Descrição: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas 2020-01-20T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10400.5/19939 Título: Contribution to the discriminant power of some of the variables involved in the staging of severe equine asthma syndrome Autor: Simões, Joana de Sousa Azevedo Resumo: Severe Equine Asthma Syndrome (EAS) is a highly prevalent, chronic and recurrent respiratory disease which appears to be related to equine domestication. Due to its insidious nature, treatment may sometimes be frustrating and severe economic loses occur. Genetically susceptible individuals develop airway inflammation, hyperresponsiveness and obstruction when exposed to environments with high concentrations of respirable dust particles, which include mould spores, mites, endotoxins, pollen and other antigenic materials. These hazardous respirable dust concentrations are usually found in traditional equine housing systems, while lower concentrations tend to be present in outdoor systems (pasture). The management of severe EAS essentially requires environmental control to ensure improvement of lung function and in some cases medical treatment with corticosteroids and bronchodilators to ameliorate the clinical signs of airway inflammation and bronchospasm. Considering the clinical importance of this syndrome, the dissertation focuses on further contributing to scientific knowledge of severe EAS. As such, we investigated the influence of lung function tests on the diagnosis and staging of the disease and developed a staging method using only portable equipment, which has the potential of being used in equine ambulatory practice. We also investigated the relation between severe EAS and resistance to gastrointestinal parasites, which had not been, to the author’s knowledge, previously reported in the Lusitano breed horses. This association has been reported in other equine breeds with severe EAS or with other multiple hypersensitivities (MHS). Lastly, because allergen avoidance is fundamental for the remission of severe EAS we examined owner compliance to a set of recommended guidelines for environmental management.; RESUMO - A síndrome de asma equina (SAE) grave é uma doença respiratória crónica, recorrente e altamente prevalente em animais adultos, estando associada à domesticação dos equinos. Devido à sua natureza insidiosa, o tratamento é muitas vezes frustrante, originando perdas económicas significantes. Quando expostos a ambientes com elevadas concentrações de partículas respiráveis, tais como esporos de fungos, ácaros, endotoxinas, pólen e outras partículas antigénicas, os animais geneticamente suscetíveis desenvolvem inflamação, hiper-reactividade e obstrução das vias aéreas. As concentrações de partículas respiráveis elevadas encontram-se normalmente presentes em sistemas de estabulação de equinos tradicionais, enquanto que em sistemas em extensivo (pastagem) estas concentrações tendem a ser menores. Assim, no maneio da SAE grave é essencial o controlo ambiental de modo a assegurar a melhoria da função pulmonar e em alguns casos o tratamento médico com corticosteroides e broncodilatadores para reduzir os sinais clínicos de inflamação das vias aéreas e broncospasmo. Tendo em conta a importância clínica desta síndrome, esta dissertação tem por objetivo contribuir para o conhecimento científico da SAE grave. Assim sendo, investigámos a influencia dos testes de função pulmonar no diagnóstico e estadiamento da doença e desenvolvemos um método de estadiamento, utilizando apenas equipamento portátil, o qual poderá ser utilizado na clínica em regime de ambulatório. Ainda, investigámos a relação entre SAE grave e a resistência a parasitas gastrointestinais, a qual até à data ainda não havia sido reportada em cavalos Puro Sangue Lusitanos. Esta associação foi, contudo, descrita em equinos de outras raças diagnosticados com SAE grave ou outras hipersensibilidades múltiplas. Por fim, considerando que a remoção de aeroalérgenos é fundamental para a remissão da SAE grave, procurámos avaliar a complacência dos donos dos animais asmáticos a um conjunto de recomendações de maneio ambiental. Descrição: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na especialidade de Clínica 2020-02-14T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10400.5/19600 Título: The role of endothelial Dll4 in cancer metastasis Autor: Dias, Liliana Mendonça da Silva Resumo: The metastatic spread of cancer is still the major barrier to the treatment of this disease. Cancer-mortality is mainly due to recurrence and metastasis. Although much has been done in the field of cancer treatment, prevention and approach to metastases are still areas not fully explored. Over and under-expression of Dll4/Notch signaling has been demonstrated to impair tumor growth through opposing patterns of vascular modulation in different mouse tumor models and human cancer xenografts. Recent evidence implicates Dll4/Notch pathway in the metastasis mechanism, but less is known about the specific role of endothelial Dll4. For this reason, we proposed to investigate how endothelial Dll4 expression interferes with the metastatic process. To address it we used a spontaneous metastasis mouse model based on Lewis Lung Carcinoma (LLC) subcutaneous transplants in endothelial-specific Dll4 lossof- function (eDll4cKO) and endothelial-specific Dll4 over-expression (D4OE) mice. Results demonstrated that eDll4cKO is responsible for the vascular function regression that leads to tumor growth reduction. Early steps of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and cancer stem cell selection were also inhibited by eDll4cKO, leading to a substantial reduction of circulating tumor cells and reduction in the number and burden of macrometastases. Intravasation and extravasation were also compromised by eDll4cKO, possibly due to blockade of the metastatic niche. In the case of the D4OE mice we observed that tumor growth reduction was achieved by vessel proliferation restriction along with an improved vascular maturation, which allowed a more efficient delivery of chemotherapy. This last effect of vessel normalization seemed to prevent metastasis formation even though EMT markers were increased. In conclusion, despite the opposite vascular architecture phenotypes of eDll4cKO and D4OE, both lead to a reduction in metastasis. This is in line with the concept of Dll4 dosage observed in the wound-healing context and represents a promising therapeutic approach in metastasis prevention/ treatment.; RESUMO - A importância da expressão endotelial do ligando Dll4 no processo de metastização - O cancro é, atualmente, uma das principais causas de morte em todo o mundo, a par das doenças cardiovasculares e da doença pulmonar obstrutiva crónica. A mortalidade por cancro está frequentemente associada à metastização, quer seja pelo compromisso hemodinâmico, quer seja pelas consequências do seu tratamento. Apesar dos avanços no tratamento do cancro, com novos agentes biológicos e imunomodeladores, a investigação do mecanismo da metastização, prevenção e abordagem das metástases continuam a ser áreas pouco exploradas. A via Notch é uma via de sinalização intercelular altamente conservada que está envolvida na determinação do destino, regulação da proliferação e diferenciação celulares. O ligando Dll4 tem uma expressão predominantemente endotelial arterial e capilar, crítica para o correto desenvolvimento embrionário, mas restringindo-se às pequenas artérias e capilares no adulto em homeostasia. Ele atua como agente anti-angiogénico em situações de “stress” fisiológico e em contexto tumoral, promovendo a ocorrência de pausas ritmadas na fase de crescimento vascular ativo, que são conducentes à maturação funcional da vasculatura nascente. Os efeitos do aumento e diminuição da expressão do ligando Dll4 sobre a dinâmica tumoral já foram extensamente estudados em modelos tumorais de ratinhos transgénicos e com xenografos. Geralmente, a ativação aberrante da via de sinalização Dll4/Notch está associada a mau prognóstico e probabilidade de metastização. Por outro lado, as terapias de bloqueio Dll4/Notch têm-se revelado eficazes no tratamento de modelos tumorais resistentes às terapias baseadas no “vascular endotelial growth factor” (Vegf), em modelos pré-clínicos. Estudos recentes implicam a ativação da via Notch nas células endoteliais, com alteração do seu fenótipo de forma a favorecer a transmigração das células tumorais, bem como a secreção de “vascular cell adhesion molecule-1”, que promove a adesão de leucócitos e potencia os fenómenos de intravasação e extravasação. Nesse sentido, surge a oportunidade de explorar o papel do ligando Dll4, em concreto, de que forma é que a sua expressão endotelial influencia as várias etapas da cascata da metastização. Para isso, usamos um modelo murino de metastização espontânea que consistiu na injeção subcutânea de células Lewis Lung Carcinoma (LLC) em dois tipos de ratinhos transgénicos: ratinhos com perda-de-função ou sub-expressão endotelialespecífica de Dll4 e ratinhos com ganho-de-função ou sobre-expressão endotelialespecífica de Dll4. Relativamente ao estudo da influência do ganho-de-função endotelialespecífico de Dll4 sobre o tumor primário, foram também usados outros ratinhos: o modelo de papiloma da pele induzido quimicamente e o modelo murino transgénico RIP-Tag2, com insulinoma. Para avaliar a angiogénese do tumor primário foram determinados parâmetros como: densidade, maturidade, funcionalidade e permeabilidade vasculares. Depois de explorado o efeito de Dll4 sobre o fenómeno de transição-epitélio-mesenquimal (EMT), in vitro, procurou-se explorar o mesmo, in vivo, com recurso aos ratinhos mutantes endoteliais-específicos citados. EMT foi caracterizada através da marcação imunofluorescente para Snail-1 e Twist. As células tumorais estaminais (CSC) foram exploradas através da marcação imunofluorescente para p63 e CD49f. A hipóxia tumoral foi avaliada através do teste com “Hypoxyprobe”. O circuito das células tumorais metastáticas foi analisado com recurso à marcação das células com uma proteína verde fluorescente, recorrendo às técnicas de imunofluorescência e “fluorescent associated cell sorting”. A análise da expressão génica foi feita através do “quantitative real time polymerase chain reaction”, tanto nos ratinhos com perda, como ganho-de-função endotelial-específico de Dll4. Quanto ao estudo da perda-de-função endotelial-específica de Dll4 foi possível avaliar, genericamente, todas as etapas da metastização. Começando pelo tumor primário, verifica-se que ocorre uma redução considerável do seu crescimento, em parte devido à angiogénese que, apesar de aumentada, é desorganizada e menos funcional. A árvore vascular apresenta inúmeras ramificações e um revestimento peri-vascular insuficiente (redução de células de músculo liso, dos marcadores α-SMA e Pdgfr-β), indicativo de imaturidade vascular. Observa-se um aumento da permeabilidade, que leva a fenómenos de exsudação e consequente má perfusão do tumor. Este endotélio disfuncional acaba por sofrer regressão, condicionando o crescimento tumoral. Constata-se que eventos iniciais como a EMT e a seleção de clones de células tumorais estaminais (CSC) são inibidos pelo bloqueio endotelial-específico de Dll4, conduzindo a uma redução do número de células tumorais circulantes e do número e crescimento das macro-metástases. Os fenómenos posteriores de intravasação e extravasação estão também reduzidos, provavelmente pela não sinalização do tumor primário à medula óssea, via Dll4/ Notch1/ Hey1/ TGF-β. Pelo que, há uma redução da mobilização de células mieloides Cd11c+/VEGFR-1+ para o nicho metastático (pulmão) e fraca deposição de fibronectina, que seria essencial para a acomodação das células tumorais circulantes/metastáticas. De salientar, que não ocorre sinalização parácrina entre o endotélio pulmonar e as células tumorais metastáticas, já que não se verifica marcação para N1ICD pulmonar. No caso da avaliação do papel do ganho-de-função endotelial-específico de Dll4, verificouse que a redução do crescimento tumoral resulta duma diminuição da angiogénese (com redução concordante da expressão dos receptores pro-angiogénicos Vgfr1 e Vgfr2), mas também da sua normalização. Trata-se duma árvore vascular com poucas ramificações, com características de maturidade evidenciadas pelo grande revestimento peri-vascular (aumento de células de músculo liso, dos marcadores α-SMA, Pdgfr-βe Ephrin-B2), permitindo um fluxo sanguíneo eficiente, ainda que inferior ao normal, pela redução da densidade vascular. Este efeito, aparentemente paradoxal (contra-intuitivo), acaba por promover um melhor aporte da doxorrubicina (quimioterápico), com bloqueio do crescimento e/ou indução da apoptose tumoral. Esta normalização parece também inibir a metastização, já que apesar de haver um aumento da expressão dos marcadores de EMT, essas células tumorais acabam por ficar “aprisionadas” no endotélio tumoral, dado que se constata uma redução do número de macro-metástases. No entanto, este modelo carece de clarificação no número de células tumorais circulantes, bem como nas restantes etapas da metastização que não chegaram a ser exploradas. Em ambos os modelos, verifica-se que é a função endotelial Dll4/Notch, e não a hipóxia tumoral, que determina a sinalização para EMT e seleção de CSC. Concluindo, observa-se no contexto da dinâmica tumoral fenótipos opostos para os modelos de perda e ganho-de-função endotelial-específico de Dll4, em linha com o que já foi descrito para o contexto da cicatrização de feridas. Estamos novamente perante o conceito de dose-dependência de Dll4, com aparente repercussão também na metastização. Isto porque o fenótipo final é o mesmo, de redução do número de macrometástases, apesar das diferenças na angiogénese tumoral e no evento inicial de EMT, ficando por explorar a restante cascata da metastização. O uso do ligando Dll4, na forma de sub ou sobre-expressão, pode constituir uma nova abordagem terapêutica ao tratamento dos cancros da mama e colo-rectal metastizados, a par de outros anti-angiogénicos já utilizados. Mas mais interessante será explorar a sua abordagem como fármacos antagonistas ou agonistas, numa estratégia de prevenção da metastização. Descrição: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, especialidade de Ciências biológicas e biomédicas 2019-10-02T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10400.5/18208 Título: Human-canine dyads : identifying dysfunctional relationships, a portuguese case Autor: Teixeira, Rute Saraiva Canejo dos Santos Rodrigues Resumo: The human-dog dyad is thought to be the oldest existing domestic partnership and is generally mutually beneficial for both members of the partnership. Dysfunction in the human-dog dyad, however, produces serious consequences for each member of the partnership and also for society at large. Research into these relationships has addressed only the consequences of dysfunction, making prevention difficult. This project set out to evaluate the possibility of pre-emptively identifying dysfunction in such dyads by using dog health histories easily available in clinical contexts. To that end, the researcher developed a simple, one-page questionnaire that was disseminated in the greater metropolitan areas of Lisbon, Portugal, and was made available online. By identifying a dog’s biting history, trauma, or involvement in a vehicular accident, the researcher was able to suggest the possibility of the dog’s involvement in a dysfunctional dyad. To classify the canine behaviour traits essential for establishing the general characteristics of dysfunctional dyads, the researcher developed the European Portuguese Canine Behaviour Assessment and Research Questionnaire (C-BARQ). The psychometric properties were evaluated, and the instrument showed excellent to respectable consistency. The result was a canine behavioural questionnaire that established 13 different personality traits. A more extensive questionnaire was then administered to the same population in Lisbon, Portugal, aimed at identifying husbandry and noting dog and human characteristics within dysfunctional dyads. The results suggest that dogs housed on verandas or on plots of land, dogs that were fed diets purchased at agricultural cooperatives, dogs with C-BARQ scores showing high owner-directed aggression (ODA), dog-directed agressoion/fear (DAF) and dog rivalry (DR) were more likely to be part of dysfunctional dyads. Similarly, owners with high neuroticism scores and low lie/social desirability scores on the Eysenck Personality Questionnaire (EPQ-R) were also more likely to be part of these partnerships. These characteristics were then used to develop two predicative models – the Predicted Dysfunction with Dog and Owner Characteristics (PDDOC) and the Predicted Dysfunction with Dog Characteristics (PDDC) – that successfully predicted dysfunction in 79.7% and 80.1% of cases respectively. These findings reveal the feasibility of pre-emptively identifying dysfunctional human-dog dyads. As a result, this pre-emptive identification can be used to take preventative action – specifically the development of educational programs, the improvement of human-dog pairings, and the equipping of veterinarians to better prevent and/or correct dysfunction.; RESUMO - A díade homem-cão é considerada a mais antiga parceria doméstica, sendo tida como mutualmente benéfica para ambos os membros. Quando estas díades se tornam disfuncionais pode haver sérias consequências, não apenas para os membros da díade, mas para a sociedade no seu todo. A disfuncionalidade de díades tem sido abordada em diversos estudos, contudo somente após se terem sentido as suas consequências nefastas, o que dificulta o processo de implementação de medidas preventivas. Este projecto teve como objetivo a sua identificação precoce, usando para isso, o historial de saúde do animal disponibilizado em contexto clínico. Foi desenvolvido um questionário sucinto de uma página, o qual foi distribuído a proprietários em Centros de Atendimento Médico-Veterinário (CAMV) na Área Metropolitana de Lisboa e também em formato online. A identificação de ocorrência de mordedura, trauma ou atropelamento foi associado a díade disfuncional. Foi desenvolvido o European Portuguese Canine Behaviour Assessment and Research Questionnaire – C-BARQ (Questionário de Investigação e Avaliação de Comportamento Canino) com o intuito de estabelecer bases gerais que permitissem classificar alguns aspetos do comportamento canino. Avaliaram-se as propriedades psicométricas e o instrumento mostrou um intervalo de consistência do respeitável ao excelente. O resultado final foi um questionário de comportamento canino que estabeleceu 13 traços de personalidade diferentes. Administrou-se seguidamente um questionário mais extenso à mesma população, mas agora com a finalidade de identificar características tanto do homem como do cão nestas díades disfuncionais. Observou-se que cães alojados em varandas ou em terrenos, alimentados com rações compradas em cooperativas agrícolas ou que apresentaram valores elevados nos scores de ODA, DAF e DR no C-BARQ, têm uma maior tendência de fazer parte de uma díade disfuncional. Proprietários que no questionário de personalidade humana, EPQ-R apresentaram um valor elevado em neuroticismo e baixo em mentira/desejabilidade social também partilham esta tendência. Estas características foram então usadas no desenvolvimento de dois modelos preditivos (PDDOC e PDDC), cujos resultados previram disfunções em 79,7% e 80,1% dos casos, respetivamente. Estes resultados, possibilitarão o desenvolvimento de programas educacionais, escolha mais informada na adoção de animais em abrigos, bem como dar aos médicos veterinários ferramentas para identificar e eventualmente prevenir e/ou corrigir algumas destas disfunções. Descrição: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na Especialidade de Clínica 2019-07-01T00:00:00Z