Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.5/5875
Título: Insights into the role of “prion-like” genes and proteins on scrapie susceptibility and ram fertility
Autor: Pimenta, Jorge Manuel Botelho Garcia Andrade
Orientador: Pereira, Rosa Maria Lino Neto
Prates, José António Mestre
Palavras-chave: anticorpo
carneiro
Doppel
espermatogénese
péptido sinal
polimorfismo
prião
prnd
Prt
reprodução
RMN
antibody
polymorphisms
prion
ram
reproduction
spermatogenesis
Data de Defesa: 5-Jun-2013
Editora: Universidade Técnica de Lisboa. Faculdade de Medicina Veterinária
Citação: Pimenta, J.M.B.G.A. (2013). Insights into the role of “prion-like” genes and proteins on scrapie susceptibility and ram fertility. Tese de Doutoramento. Universidade Técnica de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária, Lisboa.
Resumo: The established association between polymorphisms of prnp prion gene and susceptibility to scrapie disease in sheep prompted the development of breeding programmes aimed at increasing the natural resistance to scrapie in the European Union. In order to study the possible undesirable consequences from the widespread selection for the prnp genotype on ovine genetic diversity and reproduction, we primarily focused our investigation in the ovine prnd gene which encodes a prion-like protein designated as Doppel that maps to the same chromosomal region as prnp, but is mainly expressed in testis. When prnd is overexpressed in the nervous tissue, Doppel is neurotoxic and causes neurodegenerative disease. We genotyped 460 animals (207 female and 253 male) from 8 Portuguese sheep breeds (Bordaleira entre Douro e Minho, Churra Badana, C. Galega Mirandesa, C. Mondegueira, Merino da Beira-Baixa, M. Branco, Saloia e Serra da Estrela), for prnp and prnd and established a parallel between a polymorphism in the prnd gene (78G>A) and scrapie susceptibility. We also identified an association between prnd polymorphisms and fertility traits. Upholding the emphasis on ovine reproduction, recombinant Doppel (rDpl) was supplemented in different concentrations to ram spermatozoa during the capacitation process. Regardless of dosage, rDpl improved sperm individual motility and vigour, and enhanced in vitro spermatozoa fertilizing ability. In addition, we determined by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy the three-dimensional structure of the N-terminal (1-30) ovine Doppel (OvDpl) peptide, encompassing the 78G>A polymorphism and the entire signal peptide sequence. The new solved three-dimensional structure was subsequently used to construct molecular models with the M-domain of the signal recognition particle subunit (SRP54M). Simultaneously, we were able to obtain soluble mature Dpl protein through the co-expression with the SUMO chaperone. Finally, we developed a new polyclonal antibody (APPA) demonstrating for the first time that the recently discovered ovine prnt gene is a translated protein-coding gene and not a pseudogene, and identified through immunofluorescence and immunohistochemistry the location pattern of the encoded protein Prt in ram testis along spermatogenesis and in ejaculated spermatozoa. These results guided us to our last work, where data obtained through Prt blockage pointed to a physiological role for Prt in ovine fertilization (possibly through an interaction with zona pellucida proteins), reinforcing the importance of prion-like genes and proteins in the ovine reproductive physiology.
RESUMO - Estudo do efeito de genes e proteínas do tipo priónico na susceptibilidade ao tremor epizoótico e na fertilidade de ovinos - A relação estabelecida entre os polimorfismos do gene priónico (prnp) e a susceptibilidade ao tremor epizoótico determinou o desenvolvimento de programas de seleção, visando aumentar a resistência a esta doença no efetivo ovino de países da União Europeia. A fim de estudar as eventuais consequências indesejáveis por parte da seleção generalizada para o genótipo prnp ao nível da diversidade genética e das características reprodutivas dos ovinos, centrámos inicialmente o nosso trabalho no gene prnd, que codifica uma proteína do tipo priónico designada por Doppel. Este gene localiza-se na mesma região cromossómica do gene prnp, mas a sua expressão fisiológica ocorre maioritariamente no testículo, ao contrário do gene prnp cuja expressão apresenta maior afinidade para o sistema nervoso. De facto, a proteína Doppel apresenta características de neurotoxicidade quando a sua sobrexpressão é induzida no tecido nervoso. No nosso estudo, começámos por genotipar 460 ovinos (207 fêmeas e 253 machos) de 8 raças (Bordaleira entre Douro e Minho, Churra Badana, C. Galega Mirandesa, C. Mondegueira, Merino da Beira-Baixa, M. Branco, Saloia e Serra da Estrela), ao nível dos genes prnp e prnd, estabelecendo posteriormente uma associação entre um polimorfismo no gene prnd (78G>A) e a susceptibilidade ao tremor epizoótico. Foi igualmente possível identificar uma associação entre os polimorfismos detetados no gene prnd e certos parâmetros reprodutivos dos ovinos. Posteriormente, quando adicionámos doses crescentes de proteína Doppel recombinante (rDpl) ao meio de capacitação de espermatozoides de carneiro verificámos uma melhoria na motilidade individual e vigor dos espermatozoides, assim como na sua capacidade de fertilização in vitro. Foi igualmente possível determinar por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) a estrutura tridimensional da região N-terminal (1-30) da proteína Doppel ovina (OvDpl), permitindo caracterizar melhor uma região que abarca o referido polimorfismo e a sequência integral do péptido de sinal desta proteína. Esta nova estrutura foi posteriormente utilizada em estudos bioinformáticos de docking com o domínio M da proteína de reconhecimento do sinal (SPR54M). Simultaneamente, fazendo uso das propriedades de chaperone da proteína SUMO, foi possível expressar a proteína Dpl ovina na forma solúvel. Finalmente foi desenvolvido um novo anticorpo policlonal demonstrando pela primeira vez que o gene prnt é um gene funcional, tendo sido possível identificar através de técnicas de imunofluorescência e imunohistoquímica, o padrão de localização da proteína Prt ovina em células germinativas no decurso da espermatogênese, e em espermatozoides ejaculados. De forma a complementar os dados obtidos foi realizado o bloqueio da Prt ovina durante a fertilização in vitro, sendo assim possível obter indicadores que apontam para um papel de relevo por parte desta proteína ao nível da fase inicial da fertilização (eventualmente ao nível da ligação dos espermatozoides à zona pelúcida), reafirmando assim a importância das proteínas do tipo priónico na fisiologia reprodutiva dos ovinos.
Descrição: Tese de Douoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Produção Animal
URI: http://hdl.handle.net/10400.5/5875
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