Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.5/2007
Título: Análise proteómica das fracções subcelulares de uma linha celular de neuroblastomas humanos
Autor: Esteves, Stella Tatiana Liahuca
Orientador: Ferreira, Ricardo Boavida
Palavras-chave: subcellular fractionation
two dimentional electrophoresis
neurodegenerative disorders
fraccionamento subcelular
electroforese bidimensional
doenças neurodegenerativas
Data de Defesa: 2009
Resumo: The human brain is a very demanding organ in what comes to deal with energy expenses. It is a complex organ and his biochemical characteristics, makes it prone to oxygen stress. To meet brain needs, mitochondrion is the main organelle that supplies energy. This organelle is implicated in several diseases, among those: diabetes, myopathies, and cancer and neurodegenerative diseases. On the other hand, nucleus is the most complex organelle in the cell, and nuclear proteins play a major role in controlling cell functions. Thus, studying these two organelles is very important in order to understand more about several diseases, neurodegenerative disorders included. To study neurodegenerative diseases, proteomics have been used successfully in several studies, but one of the drawbacks of proteomics is that this powerful methodology cannot resolve all the proteins present in eukaryotic proteomes. Thus it is clear that a natural way to analyze the content of a proteome is to fractionate it into discrete groups and then analyze separately each group. Therefore, the objective of this study was to optimize subcellular fractionation of SK‐N‐MC cell line, to obtain the nuclear and mitochondrial proteomes, thus in the future, we could make their proteomic characterization. To achieve our goal to optimize subcellular fractionation we used isopycnic centrifugation in discontinuous gradient and in continuous sucrose gradients, and also SDS‐PAGE. Efficacy of disruption was examined by Trypan blue staining. The amounts of proteins were measured using modified Lowry method and 2D Quant Kit, whereas the purity of mitochondrial and nuclear isolation was evaluated by Western blot analyses of mitochondrial (ATP5E) protein and nuclear protein (p53). To obtain the total translatome of the cell line SK‐N‐MC two‐dimensional electrophoresis was used. The subcellular fractionation is a very demanding technique that requires long time, to achieve an effective optimization. In the future, it will be interesting to identify some proteins in the human cell line SK‐N‐MC, by mass spectrometry.--------------------------O estudo das proteínas e das alterações que ocorrem na sua expressão durante os processos neurodegenerativos é de importância primordial. O presente trabalho teve como objectivo principal optimizar o isolamento do translatoma nuclear e mitocondrial da linha celular humana de neuroblastomas, SK‐N‐MC, para que seja possível a sua caracterização em estudos posteriores. A fracção mitocondrial foi seleccionada pois este organelo é responsável pela produção da maioria da energia celular e pela formação de espécies reactivas de oxigénio estando ainda implicada em diversas doenças neurodegenerativas. O núcleo corresponde ao organelo onde decorrem processos enzimáticos‐chave, a maioria dos quais essenciais à homeostase celular. Foi feita a optimização da metodologia do fraccionamento subcelular, utilizando a centrifugação isopícnica e a electroforese em SDS‐PAGE. Para controlo de qualidade recorreu‐se à técnica de imunodetecção em membrana. Obteve‐se, neste estudo, o translatoma total da linha celular SK‐N‐MC por electroforese bidimensional. O fraccionamento subcelular é uma técnica bastante exigente que requer muito tempo para que possa haver uma efectiva optimização. De futuro, será interessante proceder à identificação de algumas das proteínas que compõem esta linha celular por espectrometria de massa.
Descrição: Mestrado em Biologia Funcional - Instituto Superior de Agronomia
URI: http://hdl.handle.net/10400.5/2007
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